Преимущества метода ПЦР (полимеразная цепная реакция)

Среди всех методов выявления НФ бактерий, разработанных к настоящему времени, особо выделяется группа молекулярно-генетических методов, обладающих высокой чувствительностью, специфичностью и универсальностью. Молекулярно-генетический метод на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) в настоящее время является наиболее адекватным для обнаружения НФ бактерий в объектах окружающей среды. Возможность совершенствования и развития различных модификаций ПЦР позволяет решать большой спектр научных и прикладных задач, связанных с НФ бактерий. "Классический" вариант ПЦР подразумевает качественный ответ на вопрос о наличии в исследуемом образце ДНК выявляемого микроорганизма. Это существенно ограничивает его использование. Создание количественного варианта ПЦР позволило бы значительно расширить возможности исследования абиотических факторов, приводящих к образованию НФ, молекулярно-генетических основ этого процесса, а также решения ряда научно-прикладных задач, например, при проведении микробиологического мониторинга за возбудителями в окружающей среде и при лечении инфекционных заболеваний человека. Поэтому задача разработки молекулярно-генетических методов, обладающих всеми достоинствами ПЦР (чувствительностью, специфичностью и универсальностью) и сочетающих в себе количественный анализ, особенно актуальный при детекции НФ бактерий в окружающей среде и контроле возбудителя при лечении инфекционных заболеваний, является актуальной.

Впервые предложен методический подход на основе последовательных реакций обратной транскрипции и разработанного количественного варианта ПЦР для выявления и доказательства жизнеспособности бактерий в НС. Метод исключает возможность индикации нежизнеспособных, мертвых клеток, содержащих неразрушенный генетический материал, так как маркером присутствия и жизнеспособности бактерий в этом случае является короткоживущая специфическая молекула мРНК заведомо экспрессирующегося в НФ и известного исследователю гена. На модельном эксперименте с Salmonella typhimurium показано, что указанный метод можно рекомендовать для выявления жизнеспособных НФ различных бактерий в окружающей среде.

Практическая значимость: Разработаны два варианта количественной анализа результатов полимеразной цепной реакции, основанные на иммобилизации ПЦР-продуктов на твердом носителе с последующим количественным определением иммобилизованного материала и включающие следующие этапы:

) введение молекулярной метки в амплифицированный фрагмент;

) специфическое связывание амплифицированного фрагмента с целью отделения его от компонентов реакционной смеси;

) количественную детекцию метки. Методы характеризуются разным решением этапов анализа и могут быть использованы для выявления бактерий в образцах различной природы, в том числе и в клинической диагностике. В данной работе методы применены для выявления НФ и количественной оценки числа бактерий Yersinia pseudotuberculosis и Salmonella typhimurium в субстратах внешней среды. В сочетании с бактериологическим методом они позволяют дифференцировать НФ возбудителей и количественно оценивать их концентрацию в почвах и водоемах.

Другие статьи

Информационное обеспечение деятельности в экологической сфере Актуальность Обладание экологической информацией имеет первостепенное значение для последовательного и эффективного решения задач обеспечения рационального использования природных ресурсов и охраны окружающей среды всеми субъектами, участвующими в этом процессе. ...