Выделение и активация аборигенных микроорганизмов
Идентификация аборигенных микроорганизмов
В качестве объекта исследования использовали нефтезагрязненный грунт, отобранный в районе Туймазинского месторождения (Республика Башкортостан).
Выделение чистой культуры проводили методом Коха путем высева на агаризованные питательные среды - мясо-пептонный агар (МПА)
Метод заключался в следующем: проводили предварительную стерилизацию МПА в автоклаве в течение 30 минут при температуре 110ºC, давлении 0,2 МПа и стеклянной посуды в суховоздушном шкафу при температуре 160 ºC.
Нефтезагрязненный грунт в количестве 1 г вносили в пробирку с 9 мл водопроводной стерильной воды - это первое разведение (10-1). Полученное разведение тщательно перемешивали стерильной пипеткой, отбирали 1 мл суспензии и переносили во вторую пробирку, получая второе разведение (10-2). Таким же образом готовили последующее разведение (10-3).
Высев на плотную среду проводили из двух последних разведений. В чашки Петри вносили 0,05 мл суспензии соответствующего разведения и распределяли стерильным стеклянным шпателем по поверхности среды.
Культивирование проводили в термостате в течение 3 суток при температуре 28-30ºC. Предварительную идентификацию типичных колоний микроорганизмов проводили по культурально - морфологическим признакам (рост на плотных средах, способность к спорообразованию, форма и размер клеток, окраска по Граму).
Рост на плотных средах: круглые колонии неправильной формы, выпуклые, пастообразные, цвет от грязно-белого до желтого.
Из полученной колонии выделили чистую культуру микроорганизмов. Морфологическую характеристику клеток бактерий изучали на микроскопе МИКМЕД - 2 с цифровой системой. Клетки имели форму прямых и слабоизогнутых палочек, подвижны.
Способность к спорообразованию осуществляли следующим образом:
суспензию 5-7 - суточной культуры аборигенных микроорганизмов в количестве 2 мл переносили в стерильную пробирку. Эту пробирку и пробирку с таким же объемом воды и термометром ставили на водяную баню. Режим пастеризации проводили в течении 10 минут при 80ºC. По прошествии этого времени суспензию высевали на поверхность скошенной среды МПА. Инкубирование проводили в термостате в течении 3 суток при температуре 28-30ºC
В результате отмечали отсутствие спор; выделенная культура бактерий относится к неспорообразующим.
Для идентификации также провели окраску по Граму.
На одном обезжиренном стекле делали мазки разных микроорганизмов: в центре - мазок исследуемой культуры, слева и справа, соответственно, грамотрицательные микроорганизмы рода Pseudomonas и грамположительные микроорганизмы рода Rhodococcus. Мазки высушивали на воздухе и фиксировали над пламенем горелки.
В течении 1-2 минут, мазки окрашивали карболовым генциановым фиолетовым, затем краситель сливали и обрабатывали раствором Люголя в течении 1-2 минут до почернения. Сливали раствор Люголя и обрабатывали препарат для обесцвечивания - 0,5 - 1,0 минут 96%-ным этиловым спиртом с добавлением йода (2 мл 10%-го спиртового раствора йода на 100 мл этанола).
Препарат промывали водой и дополнительно окрашивали водным фуксином в течении 1-2 минут. Краситель сливали, препарат промывали водой, высушивали и микроскопировали с иммерсионной системой
Наблюдали красный цвет фуксина, что свидетельствует о грамотрицательном характере микроорганизмов.
В результате, штаммы бактерий предположительно являются представителями родов Pseudomonas.
Способность выделенных микроорганизмов использовать нефть в качестве единственного источника углерода определяли по методу лунки. В стерильной чашке Петри с твердой питательной средой Раймонда в центре вырезали лунку. В лунку вносили 2-3 капли нефти. Микроорганизмы высевали радиальными штрихами от лунки к периферии чашки. Чашки помещали в термостат строго горизонтально, не переворачивая. Через 5-7 суток отметили наличие роста по штриху в сравнении с контролем - ростом на среде без нефти , что указывает на их принадлежность к нефтеокисляющим бактериям. Перейти на страницу: 1 2
Другие статьи
Развитие механизма общественного участия в принятии экологически значимых решений Актуальность темы исследования. Декларация Конференции ООН по окружающей среде и развитию (Рио-де-Жанейро,1992) указывает, что экологические вопросы решаются наиболее эффективным образом при участии всех заинтересованных граждан, а отправной точкой осуществления страт ...